【高考目标定位】
1、蛋白质的提取和分离
2、PCR技术的基本操作和应用
【考纲知识梳理】
一、DNA的粗提取与鉴定
1、实验原理：DNA与杂质的溶解度不同，在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在0.14mol/l的NaCl溶液中溶解度最低。
2、实验设计：
①实验材料的选取：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。
②破碎细胞：动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。
③去除滤液中的杂质：利用DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，控制NaCl溶液的浓度去除杂质。
④DNA的析出：将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液，静置2～3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。
⑤DNA的鉴定：取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。
二、多聚酶链式反应扩增DNA片段
1、PCR原理：DNA的热变性
2、PCR反应过程：一般要经历三十多次循环，每次循环可分为变性→复性→延伸三步。
3、PCR技术中控制不同温度的意义
（1）90℃以上时变性，双链DNA解聚为单链；
（2）50℃左右时复性，两种引物与两条单链DNA结合；
（3）72℃左右时延伸，TaqDNA聚合酶促使DNA新链的合成。
三、血红蛋白的提取和分离
1、方法及原理
方法原理
凝胶色谱法根据相对分子质量的大小分离蛋白质
电泳法各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同来分离蛋白质
2、操作程序：
（1）样品处理：
红细胞的洗涤→血红蛋白的释放→分离血红蛋白溶液
（2）粗分离??透析：除去样品中相对分子质量较小的杂质。
（3）纯化：一般采用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离和纯化。
（4）纯度鉴定：一般用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法来测定蛋白质的分子量，即对血红蛋白进行纯度鉴定。
3、细胞内DNA复制与PCR技术的比较
细胞内DNA复制PCR
不同点[高考资源网]解旋在解旋酶作用下边解旋边复制80℃~100℃高温解旋，双链分开
酶DNA解旋酶、DNA聚合酶TaqDNA聚合酶
引物RNADNA或RNA
温度体内温和条件高温
相同点（1）需提供DNA复制的模板
（2）四中脱氧核苷酸作原料
（3）子链延伸的方向都是从5?端到3?端
（4）都需要酶的催化
【要点名师精解】
一、DNA粗提取中注意事项
1、实验过程中两次用到蒸馏水，第一次目的是使成熟的鸡血细胞涨破释放出DNA，第二次目的是稀释NaCl溶液，使DNA从溶液中析出。
2、预冷的酒精溶液具有以下优点:
（1）抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解。
（2）降低分子运动易于形成沉淀析出。
（3）低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。
【例1】关于DNA粗提取与鉴定实验的有关说法中正确的是（ ）
A.充分理解DNA的盐溶液是0.14mol/L的NaCl溶液
B.实验中提取较纯净的DNA利用了DNA不溶于酒精的特点
C.对最后提取出的DNA用二苯胺试剂鉴定时不需要加热
D.实验操作过程中先后两次加入蒸馏水的作用相同
【解析】DNA在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最小。提取较纯净的DNA时可加入95%的冷却的酒精，由于DNA不溶于酒精，DNA会从溶液中析出。DNA溶液中加入二苯胺试剂加热后才会变成蓝色。实验操作中先后两次加入蒸馏水的作用不相同，第一次加入蒸馏水是使细胞吸水胀破，释放出核物质，第二次加入蒸馏水是降低NaCl浓度，使DNA析出。
【答案】B。
【感悟高考真题】
（2010?广东高考）22.新技术的建立和应用对生物学发展至关重要。下列技术（或仪器）与应用匹配正确的是
A.PCR技术??扩增蛋白质
B.杂交瘤技术??制备单克隆抗体
C.光学显微镜??观察叶绿体的基粒
D.花粉离体培养??培育单倍体植物
【解析】本题主要考查学生的理解能力。PCR技术只能用来扩增核酸，不能用来扩增蛋白质；利用光学显微镜无法观察到叶绿体。
【答案】BD
（2010?江苏高考）32．(7分)某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动。具体步骤如下：
材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份．每份l0 g。剪碎后分成两组，一组置于20℃、另一组置于一20℃条件下保存24 h。
DNA粗提取：
第一步：将上述材料分别放人研钵中，各加入l5 mL研磨液，充分研磨。用两层纱布过滤．
取滤液备用。
第二步：先向6只小烧杯中分别注人10mL滤液，再加人20 mL体积分数为95％的冷酒精
溶液，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。
第三步：取6支试管，分别加入等量的2 mol／L NaCl溶液溶解上述絮状物。
DNA检测：在上述试管中各加入4 mL二苯胺试剂。混合均匀后，置于沸水中加热5 min，待试管冷却后比较溶液的颜色深浅,结果如下表。
分析上述实验过程，回答下列问题：
(1)该探究性实验课题名称是 ▲ 。
(2)第二步中”缓缓地”搅拌，这是为了减少 ▲ 。
(3)根据实验结果，得出结论并分析。
①结论1：与20℃相比，相同实验材料在-20℃条件下保存，DNA的提取量较多。
结论2： ▲ 。
②针对结论I．请提出合理的解释： ▲ 。
(4)氯仿密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNA均不相溶，且对DNA影响极小。为了进一步提高DNA纯度，依据氯仿的特性．在DNA粗提取第三步的基础上继续操作的步骤是： ▲ 。然后用体积分数为95％的冷酒精溶液使DNA析出。
【解析】本题考查了DNA粗提取技术的原理、操作过程及同学分析、判断能力，从题目实验看出，该实验的课题是探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响。在试用第二步中，为了防止DNA断裂，要缓缓的搅拌，从表中结果看出，由于低温抑制了相关酶的活性，DNA降解慢，使得相同材料在低温保存下，DNA提取量大，在相同条件先，蒜黄蓝色最深，说明相同条件下从蒜黄中提取的DNA量最大，由于氯仿密度比水大，可使蛋白质变性后沉淀，而与水、DNA不相溶，这样可将第三步获得的溶液与等量的氯仿混合，静置一段时间，吸取上清液即可得到较纯净的DNA。
【答案】（1）探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响
（2）DNA断裂
（3）①等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄提取的DNA量最多
⑦低温抑制了向光酶的活性，DNA降解速度慢
（4）将第三步获得的溶液与等量的氯仿充分混合，静置一段时间，吸取上清液
（2009?江苏高考）23．下列关于DNA和蛋白质提取与分离实验的叙述，正确的有
A．提取细胞中的DNA和蛋白质都需用蒸馏水涨破细胞
B．用不同浓度NaCl溶液反复溶解与析出DNA可去除蛋白质
C．蛋白质提取和分离过程中进行透析可去除溶液中的DNA
D．蛋白质和DNA都可以用电泳的方法进行分离纯化
【解析】A选项，在提取DNA时，如果是用动物的细胞需要用蒸馏水涨破，如果用植物细胞则不需要，而是用洗涤剂溶解细胞膜；用2 mol／L的NaCl溶液溶解DNA，然后过滤出蛋白质，再降低NaCl溶液的浓度，析出DNA。DNA和蛋白质样品都是带负电荷的，从负极向正极移动，移动的距离都和样品的分子量有关。C中透析用以出去小分子物质，DNA是大分子物质，D是常规方法比如用十二烷基磺酸钠，可以根据其分子大小及所带电荷性质进行分离纯化
【答案】BD
（2008?江苏高考）下列叙述中错误的是
A．改变NaCl溶液的浓度只能使DNA溶解而不能使其析出
B．在沸水浴中，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色
C．用电泳法可分离带电性质、分子大小和性状不同的蛋白质
D．用透析法可去除蛋白质样品中的小分子物质
【解析】当NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，随浓度的升高，DNA的溶解度降低；当NaCl溶液浓度高于0.14mol/L时，随浓度升高，DNA的溶解度升高；NaCl溶液浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最低。因此，改变NaCl溶液的浓度可以使其析出。
【点评】本题考查生物大分子DNA和蛋白质分离的有关知识，属于识记层次。
【答案】A。
【考点精题精练】
1.在制备鸡血细胞液的过程中，加入柠檬酸钠的目的是（ A ）
A.防止凝血 B. 加快DNA析出 C. 加快DNA溶解 D. 加速凝血
2.关于“DNA粗提取和鉴定”的实验原理的叙述中，正确的是 C
A．用猪血为实验材料的原因是猪血的红细胞有细胞核，DNA含量多
B．利用 DNA 在2mol/L的氯化钠溶液中溶解度最低，易析出的特性提取DNA
C．利用 DNA 不溶于酒精，而细胞中的其他物质可溶于酒精的特性提纯DNA
D．利用DNA与二苯胺作用而显现紫色的特性鉴定DNA
3.在DNA粗提取与鉴定实验中，将获得的含有DNA的黏稠物(含较多物质)分别处理如下 C
①放入2mol／L的氯化钠溶液中，搅拌后过滤，得到黏稠物A和滤液a；
②放入O.14 mol／L的氯化钠溶液中，搅拌后过滤，得到黏稠物B和滤液b；
③放入冷却的95％的酒精溶液中，搅拌后过滤，得到黏稠物C和滤液c。
以上过程获得的滤液和黏稠物中，因为只含有少量DNA而可以丢弃的是
A．AbC B．ABc C．Abc D．abc
4.（2010?江苏省盐城市高三第二次凋考）在“DNA的粗提取和鉴定”实验中，甲、乙、丙、丁四个小组除下表中所列处理方法不同外，其他操作步骤均正确，但实验结果却不同。下列有关叙述不正确的是 D
A．实验材料选择错误的组别是丙
B．沸水浴后试管中溶液颜色变蓝的组别是甲、丁
C．甲组实验现象差的原因是25℃的酒精对DNA的凝集效果差
D．乙组实验不成功仅因为在鉴定时加入了双缩脲试剂
5.关于DNA在NaCl溶液中的溶解度，下面的叙述不正确的是（ABC）
A．随着NaCl溶液浓度的增大，DNA在NaCl溶液中的溶解度也增大
B．随着NaCl溶液浓度的减小，DNA在NaCl溶液中的溶解度也减小
C．DNA在NaCl溶液中的溶解度与NaCl溶液的浓度无关
D．当NaCl溶液的浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最低
6.下列关于DNA粗提取与鉴定的说法不正确的是（ABC）
A．洗涤剂能瓦解细胞膜，同时也能控制DNA在NaCl溶液中的溶解度
B．在探究洗涤剂对植物细胞DNA提取的影响实验中，需要控制的变量是洗涤剂和植物细胞
C．常温下，DNA遇二苯胺被染成蓝色
D．将滤液放在60～75℃的恒温水浴箱中保温10～15分钟能去除滤液中的杂质，其原理是利用了DNA和蛋白质对高温耐受性的不同
7.关于PCR的说法不正确的是 （ C ）
A、PCR是体外复制DNA的技术 B、Taq酶是一种热稳定DNA聚合酶
C、PCR过程中只需要两个引物分子 D、PCR利用的是DNA双链复制原理
8.（09-10?辽宁省开原高中高二下第一次月考）多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：95℃下变性（使模板DNA解旋）→55℃下复性（引物与DNA模板链结合）→72℃下延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是 C
A.变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现
B.复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成
C.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸
D.PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高
9.PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：95℃下使模板DNA变性、解链→55℃下复性（引物与DNA模板链结合）→72℃下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是 （ C ）
A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现
B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成
C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸
D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高
10.凝胶色谱法是根据（ B ）分离蛋白质的有效方法。
A.分子的大小 B.相对分子质量的大小 C.带电荷的多少 D.溶解度
11.相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个 B
12.洗涤红细胞属于血红蛋白提取和分离的 B
A粗分离 B 样品处理 C纯化 D 纯度鉴定
13.下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述错误的是 B
A．样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液
B．通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取
C．可通过凝胶色谱法将相对K考S资5源U网分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化
D．可通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度
14.在血红蛋白分离过程中，如果红色带区歪曲、散乱、变宽，与其有关的是 B
A凝胶色谱柱的制作 B色谱柱的装填 C洗脱过程 D样品的处理
15.下列那项蛋白质的性质会影响到蛋白质的泳动速度(ACD)
A．蛋白质分子的大小 B．蛋白质分子的密度
C．蛋白质分子的形状 D．蛋白质分子的等电点
16.蛋白质提取和分离一般分为哪几步（ACEF）
A．样品处理 B．凝胶色谱操作 C．粗分离
D．SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 E．纯化 F．纯度鉴定
17.在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程中，分析正确的是 D
A．洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐
B．洗涤时离心速度过低，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果
C．洗涤过程选用0.1％的生理盐水
D．透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质
18.下列有关蛋白质的分离与提纯的叙述不正确的(AC)
A．蛋白质分子的等电点不会影响到蛋白质的泳动速度
B．能够分离蛋白质的方法有透析法等
C．如果要分离与纯化血红蛋白，用到的抽提剂是碱性溶液
D．根据血清蛋白醋酸纤维薄摸电泳图谱示意图可知血清中含量最多的成分是清蛋白
19.（2010?江苏省南通、扬州、泰州三市高三二模）
下图是“DNA粗提取与鉴定”相关实验步骤，请据图分析回答：
（1）鸡血细胞是进行该实验较好的实验材料，这是因为_________________________。从鸡血细胞中释放出核物质的处理方法是_________________________。
（2）图a表示释放核物质后进行过滤的过程，过滤后取 进行下一步实验。
（3）图b表示的相关操作过程中，加入2mol/LNaCl溶液的作用是 。
（4）图c表示在滤液中加入冷却的95%的酒精，其目的是__________________________。
答案：（5分）
（1）鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得（以及鸡血细胞极易吸水胀破） 向鸡血细胞中加入蒸馏水，并搅拌
（2）滤液
（3）溶解DNA分子
（4）提取杂交更少DNA（或去除脂溶性杂质）
20.DNA在NaCl溶液中溶解度有二重性，随着NaCl溶液的变化而变化。
（1）请在下列NaCl溶液中选出溶解度能使DNA析出最彻底的一种（ ）和溶解度最高的一种（ ）
A. 0.14mol/l B. 2mol/l C. 0.15mol/l D. 0.3mol/l
（2）DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些物质却可以溶于酒精溶液，利用这一原理可以____________，可以推测溶于酒精中的物质可能有____________。
（3）利用DNA与_____变蓝色的特性，将该物质作为鉴定______的试剂。其实验过程要点是向放有_____的试管中加热4ml的____。混合均匀后，将试管置于___5min，待试管______，观察试管中溶液颜色的变化，这个实验也说明DNA耐___温。
【答案】（1）A；B
（2）除去杂质；某些脂类、蛋白质、糖类或其他大分子物质
（3）二苯胺；DNA；DNA；二苯胺试剂；沸水中水浴加热；冷却后；高
21.资料显示，近十年来，PCR技术（DNA聚合酶链式反应技术）成为分子生物实验的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制的特性，在试管中进行DNA的人工复制（如下图），在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使分子生物实验所需的遗传物质不再受限于活的生物体。请据图回答：
（1）加热至94℃的目的是使DNA样品的 键断裂，这一过程在生物体细胞内是通过 酶的作用来完成的。通过分析得出新合成的DNA分子中，A=T，C=G，这个事实说明DNA分子的合成遵循 。
（2）新合成的DNA分子与模板DNA分子完全相同的原因是
和 。
（3）通过PCR技术使DNA分子大量复制时，若将一个用15N标记的模板DNA分子（第一代）放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制到第五代时，含15N标记的DNA分子单链数占全部DNA总单链数的比例为 。
（4）PCR技术不仅为遗传病的诊断带来了便利，而且改进了检测细菌和病毒的方法。若要检测一个人是否感染了艾滋病病毒，你认为可以用PCR扩增血液中的（ ）
A．白细胞DNA B．病毒蛋白质 C．血浆抗体 D．病毒核酸
答案：（1）氢， 解旋， 碱基互补配对原则。
（2）DNA分子中独特的双螺旋结构(或以模板DNA分子的一条链为模板进行半保留复制) 复制过程中严格遵循碱基互补配对原则。
（3）1/16 。 （4） D
22.（2010?宁夏银川一中高三二模）PCR技术是把一DNA片段在体外酶的作用下，合成许许多多相同片段的一种方法，利用它能快速而特异地扩增任何要求的目的基因或DNA分子片段，它的基本过程如下图所示：
图中 表示每次扩增过程中需要的引物（加入足够多）。每个引物含20个核苷酸，并分别与DNA片段两端碱基互补，其作用是引导合成DNA子链，还作为子链的一部分，不会从模板链上脱落下来，
(1)PCR技术的原理是模拟生物体内的 过程。
(2)PCR扩增过程中需要对DNA片段进行高温处理，其目的是 ，此过程在生物体内需 酶的参与，作用部位是DNA的 键。
(3)据图分析，扩增过程中需要的引物有 种，其实质是 ，假如引物都用3H标记，从理论上计算，所得DNA分子中含有3H标记的占 。
(4)假定DNA片段含200对脱氧核苷酸，经3次扩增，从理论上计算还需要提供 个游离脱氧核苷酸。
答案：（除特别标注外，其它每空1分）
(1)DNA复制
(2)使DNA的两条链彼此分开(或解旋) 解旋 氢
(3)两 单链DNA 100％ (2分) (4)2520（2分）
23.红细胞含有大量的血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带氧气或二氧化碳，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题：
（1）血红蛋白提取和分离的程度可分为四步：______、______、______和______。
（2）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。
①加入柠檬酸钠的目的是_____。②该过程即样品处理，它包括____、_____、收集血红蛋白溶液。
（3）收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。
①透析的目的是__________________。②透析的原理是______________________________。
（4）然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。
①样品纯化的目的是______________________________。
②血红蛋白有什么特点？_____________。这一特点对进行蛋白质的分离有什么意______。
答案：（1）样品处理；粗分离；纯化；纯度鉴定（2）①防止血液凝固红细胞的洗涤，血红蛋白的释放（3）①去除分子质量较小的杂质②透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内（4）①通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去②血红蛋白呈现红色，在凝胶色谱分离时，可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液②使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。
24.红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成。我们可以选用猪、牛、羊等动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题：
（1）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。
①其中加入柠檬酸钠的目的是 。
②此过程即是样品处理，它应包括红细胞洗涤、 、分离血红蛋白溶液。
③洗涤红细胞的目的是 。
（2）收集的血红蛋白溶液在透析袋中透析，这就是样品的粗分离。
①透析的目的是 。
②透析的原理是 。
（3）然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，其目的是 最后经SDS?聚丙烯酰胺凝胶电脉进行纯度鉴定。
答案：（每空1分，共6分）
（1）①防止血液凝固（1分）；②血红蛋白的释放（1分）；③去除杂蛋白（1分）
（2）去除相对分子质量较小的杂质（1分）；
透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内（1分）
（3）通过凝胶色谱法去除相对分子质量较大的杂质（1分）
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